Nom del gen: Regulador transcripcional de la família PadR
Organisme: Lactococcus lactis subsp. cremoris
Gen: RF668_01650
Codi UniProt: A0AAX4A7G0
Classificació EC: No és un enzim (sense codi EC a BRENDA)
Font estructural: Model predictiu d’AlphaFold (sense estructura experimental al PDB)
La seqüència proporcionada es va analitzar mitjançant BLAST a la base de dades UniProt, obtenint com a millor resultat la proteïna amb codi A0AAX4A7G0, corresponent a un regulador transcripcional de la família PadR de Lactococcus lactis subsp. cremoris. Aquesta família de proteïnes es caracteritza per participar en la regulació de l’expressió gènica, habitualment mitjançant unió al DNA.
No s’ha trobat cap classificació EC a la base de dades BRENDA, fet que indica que la proteïna no és un enzim.
No s’ha identificat una estructura experimental directa per aquesta proteïna a la base de dades Protein Data Bank (PDB). Per aquest motiu, s’ha utilitzat un model predictiu obtingut mitjançant AlphaFold Protein Structure Database per a l’anàlisi estructural posterior.
Figura 1. Predicció de l’estructura de la proteïna reguladora transcripcional de la família PadR de Lactococcus lactis subsp. cremoris, obtinguda de la AlphaFold Protein Structure Database (https://alphafold.ebi.ac.uk).
Funció: La proteïna és un regulador transcripcional de la família PadR que controla l’expressió gènica mitjançant la unió a seqüències específiques de DNA. Aquesta unió permet modular (generalment reprimir) la transcripció de gens implicats en la resposta a estrès, detoxificació i adaptació metabòlica.
S’ha analitzat l’estructura predita per AlphaFold mitjançant UCSF ChimeraX. La proteïna presenta un plegament majoritàriament α-helicoidal amb algunes làmines β curtes i bucles connectors.
Les zones vermelles corresponen a les hèlix α. Aquestes tenen una estructura helicoidal compacta i regular. Es formen ponts d’hidrogen intramoleculars entre el grup C=O d’un aminoàcid residu i (és a dir, qualsevol aminoàcid) i el grup N-H del residu i + 4 (4 posicions més endevant). Aquests ponts són paral·lels a l’eix de l’hèlix i estabilitzen l’estructura.
Les zones grogues fan referència a les làmines β. Estan formades per cadenes esteses i estructura rígida i plana. En la imatge es pot observar com obtenen una configuració antiparal·lela. També formen ponts d’hidrogen però aquest cop entre cadenes adjacents entre C=O d’una cadena i N-H de l’altre.
Per últim, les zones verdes ens indiquen els bucles. Són estructures no regulars que connecten l’hèlix α amb les làmines β que permeten la flexibilitat necessària per als canvis conformacionals requerits per a la unió al DNA i la regulació de l’activitat. Aquesta estructura té interaccions amb el medi.
Figura 2. Diferents estructures secundàries. Hèlix α (vermell), làmina β (groc) i bucles (verd).
Figura 3. S’observen els ponts d’hidrogen com línies blaves discontínues.
Els ponts d’hidrogen mostrats corresponen principalment a interaccions internes que estabilitzen les estructures secundàries (hèlix α i làmines β).
S’ha identificat un motiu d’estructura supersecundària tipus helix-turn-helix (HTH) format per dues hèlixs α connectades per un loop curt. Aquest patró s’ha detectat observant l’estructura tridimensional de la proteïna amb UCSF ChimeraX.
Aquest motiu és característic de proteïnes reguladores de la transcripció i està implicat en la unió al DNA.
Figura 4. HTH (hèlix-turn-hèlix)
Amb l’anàlisi de UCSF ChimeraX s’han pogut visualitzar ponts d’hidrogen, representats amb línies discontínues, que estabilitzen tant les hèlixs α com les fulles β presents a la proteïna.
També s’ha identificat interaccions de van der Waals, que corresponen a contactes estrets entre residus propers de la proteïna (contactes entre residus de les dues hèlixs). Aquestes interaccions, tot i ser febles individualment, contribueixen conjuntament a estabilitzar l’estructura tridimensional, especialment en el motiu helix-turn-helix.
Aquest conjunt d’interaccions permet mantenir la conformació tridimensional necessària per a la funció de la proteïna.
Figura 5. Línies discontínues blaves (ponts d’hidrogen) i verdes (interaccions de van der Waals).
Estructura terciària: plegament de tipus helix-turn-helix (HTH), amb un domini principalment α-helicoidal organitzat en un α-helical bundle implicat en la unió al DNA.
En la base de dades ECOD, la proteïna es classifica dins: X-group: Helix-turn-helix DNA-binding domain i H-group: PadR-like regulators. Segons CATH, aquesta proteïna s’inclou dins: Class 1: Mainly Alpha, Architecture: Orthogonal Bundle, Topology: HTH-like fold and Homologous superfamily: PadR-like transcriptional regulators.
Com a suport, bases de dades com SCOPe també inclouen aquests dominis dins la classe all-alpha proteins, en la família de factors de transcripció amb motiu HTH.
Estructura quaternària: la proteïna forma un dímer funcional. Aquesta dimerització és essencial, ja que permet posicionar correctament els dominis HTH per a la unió al DNA i generar una cavitat interfacial implicada en la unió de lligands, clau en la regulació de la seva activitat.
Com la seqüència proporcionada que nosaltres hem obtingut no és un enzim, és un regulador transcripcional, no té un centre actiu clàssic. En lloc d’això, té un lloc on s’uneixen molècules, és a dir, un lloc d’unió a lligands. Aquesta proteïna funciona com un dímer, és a dir, està formada per dues cadenes idèntiques (monòmers) que s’uneixen per formar una estructura funcional. Aquesta proteïna no presenta un centre actiu clàssic, sinó una cavitat d’unió a lligands situada a la interfície del dímer. Aquesta cavitat té un paper regulador, no catalític.
Dins d’aquest forat es troben dos aminoàcids importants (Trp96 i Trp96’). Aquests dos residus són crucials per a l’unió de molècules mitjançant interaccions d’apilament aromàtic (π–π), estabilitzant-les dins la cavitat.
Hi ha certes molècules com Hoechst 33342, daunomicina o riboflavina que s’uneixen a aquesta cavitat actuant d’inhibidors dificultant la interacció entre la proteïna i l’ADN degut als canvis conformacionals que causen. A més de les interaccions π–π amb els residus de triptòfan, la unió dels lligands també pot implicar interaccions de van der Waals i, en alguns casos, ponts d’hidrogen amb altres residus de la cavitat, contribuint a l’estabilització del complex proteïna-lligand.
El model utilitzat correspon a un monòmer, fet que explica que només s’identifiqui un residu Trp96. En l’estructura dimèrica funcional, aquest residu es troba duplicat (Trp96 i Trp96’) formant la cavitat d’unió.
Figura 6. Cavitat d’unió a lligands amb Trp96 destacat.
La proteïna estudiada és un regulador transcripcional de la família PadR, per tant no és un enzim i no catalitza cap reacció química. Per tant, ens centrarem en la informació essencial sobre aquesta proteïna. La seva funció és regular l’expressió gènica mitjançant la unió a DNA.
Concretament, actua com a repressor transcripcional: en absència de lligands, la proteïna (en forma de dímer) s’uneix a seqüències específiques del DNA en la regió promotora i impedeix la unió de l’ARN polimerasa, inhibint així la transcripció del gen.
El mecanisme de regulació és al·lostèric i dependent de lligands. Quan petites molècules (com àcids fenòlics o altres compostos) s’uneixen a una cavitat de la proteïna, es produeix un canvi conformacional que redueix la seva afinitat pel DNA. Això provoca la dissociació de la proteïna del DNA i permet la transcripció del gen (desrepressió).
Aquest mecanisme permet a la cèl·lula respondre a canvis ambientals, regulant gens implicats en processos com la detoxificació, resistència a compostos tòxics o adaptació metabòlica.
Figura 7. Mecanisme de regulació al·lostèrica de la proteïna PadR. En absència de lligand (part superior), el dímer s’uneix al DNA i bloqueja la transcripció. La unió del lligand indueix un canvi conformacional que provoca la dissociació del DNA i permet la transcripció (desrepressió).
No s’han descrit modificacions post-traduccionals específiques per a aquesta proteïna concreta de la família PadR. No obstant això, en proteïnes reguladores de la transcripció similars, les PTMs són mecanismes habituals de regulació funcional.
Les modificacions més probables són:
Fosforilació en residus de serina (Ser), treonina (Thr) o tirosina (Tyr): que pot actuar com a interruptor molecular alterant la conformació de la proteïna i la seva afinitat pel DNA
Acetilació en residus de lisina (Lys): que neutralitza la càrrega positiva i pot disminuir la interacció amb el DNA (important en factors de transcripció)
Metilació en lisina (Lys) o arginina (Arg): que pot modular interaccions proteïna-DNA o proteïna-proteïna
Els residus més susceptibles de ser dianes són:
Residus carregats implicats en la unió al DNA (com Lys i Arg del motiu helix-turn-helix)
Residus polars exposats a superfície (Ser, Thr, Tyr), accessibles a enzims modificadors
Residus situats en la interfície de dimerització, que podrien regular l’associació dels monòmers
La funció de la proteïna com a regulador transcripcional està directament determinada per la seva estructura tridimensional. El plegament de tipus helix-turn-helix (HTH) constitueix l’element estructural clau, ja que permet el reconeixement específic i la unió al DNA. En particular, una de les hèlixs (hèlix de reconeixement) s’insereix al solc major del DNA, establint interaccions específiques amb les bases.
Motiu HTH → responsable de la unió específica al DNA
Hèlixs α → proporcionen estabilitat estructural i orientació correcta del domini d’unió
Bucles (loops) → aporten flexibilitat per adaptar-se al DNA
Interfície de dimerització → permet la formació del dímer funcional necessari per a la unió efectiva al DNA
Els residus claus per a la funció són:
Lys i Arg del motiu HTH, que interaccionen amb el DNA mitjançant interaccions electrostàtiques amb el esquelet fosfat.
Trp96 (i Trp96’ en el dímer), implicats en la unió de lligands mitjançant interaccions π–π dins la cavitat central
Figura 8. Representació electrostàtica
També son residus claus, altres residus hidrofòbics de la interfície, que estabilitzen la dimerització mitjançant interaccions de van der Waals.
Figura 9. Respresentació hidrofòbica
Variants funcionals i efectes moleculars:
Pel que fa a variants, mutacions en residus clau poden tenir efectes funcionals importants, a nivell molecular, aquestes alteracions afecten la capacitat de la proteïna per reconèixer el DNA o respondre a senyals cel·lulars, comprometent la seva funció reguladora.
UniProt Consortium. (2024). UniProt: the Universal Protein Knowledgebase. A0AAX4A7G0
AlphaFold DB. (2024). AlphaFold Protein Structure Database. Model per A0AAX4A7G0.
Madoori, P. K., et al. (2009). Structure of the transcriptional regulator PadR from Bacillus subtilis. Journal of Molecular Biology, 387(3), 759-770.
De Been, M., et al. (2008). PadR-family regulators: a structural perspective. Molecular Microbiology, 70(6), 1347-1359.